與PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)相關(guān)的指導(dǎo)文件主要有四份：
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《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》
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《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》
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《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》
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《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》
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臨床PCR實(shí)驗(yàn)室，不但在實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備等硬件上要滿足開展臨床檢驗(yàn)的條件，而且要求實(shí)驗(yàn)室在日常工作要有文件化的工作程序。
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下面就在PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)過程中的幾個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)進(jìn)行闡述:
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01 PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系
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根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體情況編寫質(zhì)量體系文件，《質(zhì)量手冊(cè)》、《程序文件》、《作業(yè)指導(dǎo)書》，并保證管理體系運(yùn)行有效。
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管理體系的特點(diǎn)是應(yīng)有明確的目的、規(guī)范的管理、有效的制約、高效的機(jī)制、能自我發(fā)展的整體。
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建立完善的SOP文件，對(duì)完成各項(xiàng)質(zhì)量活動(dòng)的方法作出規(guī)定，每個(gè)SOP都應(yīng)對(duì)一個(gè)或一組相互關(guān)系的活動(dòng)進(jìn)行描述。
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每個(gè)SOP文件應(yīng)說明該項(xiàng)質(zhì)量各環(huán)節(jié)的輸入、轉(zhuǎn)換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關(guān)活動(dòng)的接口關(guān)系。
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明確每個(gè)環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)換過程中各項(xiàng)因素的要求，即由誰做、做什么、做到什么程序、達(dá)到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報(bào)告，以及相應(yīng)的審批手續(xù)。
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規(guī)定在質(zhì)量活動(dòng)中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施。SOP應(yīng)簡(jiǎn)練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴(yán)格遵守。
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02 PCR實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)設(shè)置
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要完成一組PCR實(shí)驗(yàn)，通常需要經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物分析4個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。
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這4個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房應(yīng)相鄰布置，組成一個(gè)獨(dú)立的PCR實(shí)驗(yàn)區(qū)。標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)區(qū)包括:試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)、各區(qū)配套的緩沖區(qū)及公共走廊。
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PCR實(shí)驗(yàn)室整體平面布局
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某醫(yī)院PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局如圖1所示，整個(gè)區(qū)域有一個(gè)公用走廊，每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)有專門的緩沖區(qū)。通過壓差控制，使整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染，并且降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染。
圖表1、某醫(yī)院PCR實(shí)驗(yàn)室平面圖
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1.試劑準(zhǔn)備區(qū)
該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。
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試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。
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試劑準(zhǔn)備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱，計(jì)算冷負(fù)荷時(shí)，需要將它們計(jì)算在內(nèi)。
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房間的面積宜控制在15m2~20m2。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對(duì)正壓狀態(tài)，以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染。
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2.標(biāo)本制備區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。
標(biāo)本制備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱，計(jì)算冷負(fù)荷時(shí)，需要將它們計(jì)算在內(nèi)。在標(biāo)本制備區(qū)，還需要配備生物安全柜，用于進(jìn)行提取核酸的操作。
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為避免提取的核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán)，造成標(biāo)本之間的交叉污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，該區(qū)域配備的生物安全柜必須是B2型的。生物安全柜工作區(qū)垂直氣流全部來自實(shí)驗(yàn)室，排風(fēng)經(jīng)過高效過濾器過濾后直接排至室外，不允許回到安全柜和實(shí)驗(yàn)室中。
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根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配備生物安全柜，每配備一臺(tái)，實(shí)驗(yàn)室的面積增加10m2;標(biāo)本制備區(qū)的面積宜在25m2~30m2之間。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。
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3.擴(kuò)增室
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
在巢式PCR測(cè)定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
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擴(kuò)增室主要配備PCR實(shí)驗(yàn)室的核心儀器PCR儀。
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在實(shí)驗(yàn)室建造過程中，需要給PCR儀配備專門的UPS電源，以保證其正常工作。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。
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本區(qū)的壓力梯度要求為:相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實(shí)現(xiàn)。
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4.產(chǎn)物分析區(qū)
該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測(cè)，此區(qū)域可不設(shè)。
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在室內(nèi)配備通風(fēng)櫥，保證房間內(nèi)的相對(duì)負(fù)壓，空氣從室外流向室內(nèi)。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。
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本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此對(duì)本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實(shí)現(xiàn)。
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03 正負(fù)壓區(qū)域緩沖室的設(shè)置
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根據(jù)壓力梯度的要求，試劑配制室和樣品處理室為相對(duì)正壓，擴(kuò)增室和產(chǎn)物分析室為相對(duì)負(fù)壓，要求正壓的區(qū)域和要求負(fù)壓的區(qū)域的緩沖室內(nèi)的壓力設(shè)計(jì)大不相同。
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正壓緩沖室符合一般正壓潔凈室的緩沖原則，主要是防止室外環(huán)境空氣中的氣溶膠進(jìn)入室內(nèi)。
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負(fù)壓緩沖室則是要求緩沖室對(duì)核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析區(qū)保持正壓，對(duì)緩沖室外也保持正壓(主要是滿足室內(nèi)凈化需要，如室內(nèi)無潔凈要求，此處可以為0壓)。
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04污染的預(yù)防與控制
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PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見的有以下幾種污染類型:擴(kuò)增產(chǎn)物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。
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·??? 工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分，各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等)，以避免各個(gè)不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。
·??? 合理的系統(tǒng)設(shè)置，合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng);嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。
·??? 規(guī)范的操作，臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，在實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。清潔工作及時(shí)、正確。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后，必須立即對(duì)本區(qū)進(jìn)行清潔。
·??? 嚴(yán)格的管理:嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。在各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服(如不同顏色)，當(dāng)工作人員離開時(shí)不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域;盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性。擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等;
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新冠病毒核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室要求
1.核酸檢測(cè)過程包括標(biāo)本處理、核酸提取，進(jìn)行PCR檢測(cè)等多個(gè)步驟，平均檢測(cè)時(shí)間需要2-3個(gè)小時(shí)。由于它是直接對(duì)我們采集標(biāo)本中的病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，特異性強(qiáng)，敏感度相對(duì)較高，是當(dāng)前主要的檢測(cè)手段。
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2.《關(guān)于做好防范疫情輸入相關(guān)城市新型冠狀病毒檢測(cè)工作的通知》聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制綜發(fā)〔2020〕128號(hào)文件中要求：加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量控制，開展檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)使用經(jīng)藥監(jiān)部門批準(zhǔn)的檢測(cè)試劑和采樣拭子。疾控機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室開展PCR檢測(cè)應(yīng)當(dāng)具備相應(yīng)條件。醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室開展PCR檢測(cè)應(yīng)當(dāng)按照要求通過技術(shù)審核，在省級(jí)衛(wèi)生健康行政部門登記備案。
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疾控機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室開展新型冠狀病毒檢測(cè)，均應(yīng)當(dāng)納入質(zhì)量控制體系，開展實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)工作，并符合實(shí)驗(yàn)室生物安全要求。醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室開展新冠病毒相關(guān)檢測(cè)，應(yīng)當(dāng)符合《醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本標(biāo)準(zhǔn)（試行）》《醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范（試行）》等要求，保證生物安全和遺傳資源管理符合相關(guān)規(guī)定。
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3. 《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南（第二版）》國衛(wèi)辦科教函﹝2020﹞70號(hào) 、《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）附件<新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南>》國衛(wèi)辦疾控函〔2020〕156號(hào)均提出：根據(jù)目前掌握的新型冠狀病毒的生物學(xué)特點(diǎn)、流行病學(xué)特征、臨床資料等信息，該病原體暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進(jìn)行管理。具體要求：感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進(jìn)行的核酸檢測(cè)、抗原檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、生化分析等操作應(yīng)當(dāng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
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4. 國家衛(wèi)生健康委員會(huì)辦公廳《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)新冠肺炎疫情防控期間發(fā)熱門診設(shè)置管理和醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的通知》國衛(wèi)辦醫(yī)函〔2020〕263號(hào)中要求三級(jí)綜合醫(yī)院均應(yīng)建立符合生物安全二級(jí)及以上標(biāo)準(zhǔn)的臨床實(shí)驗(yàn)室，有條件的?？漆t(yī)院、二級(jí)綜合醫(yī)院也應(yīng)當(dāng)完善相關(guān)配備，提高冠狀病毒核酸檢測(cè)能力。
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5.《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》2018年修改：第二十五條 新建、改建或者擴(kuò)建一級(jí)、二級(jí)實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)當(dāng)向設(shè)區(qū)的市級(jí)人民政府衛(wèi)生主管部門或者獸醫(yī)主管部門備案。
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6.《關(guān)于進(jìn)一步做好疫情期間新冠病毒檢測(cè)有關(guān)工作的通知》聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制綜發(fā)〔2020〕152號(hào)：落實(shí)實(shí)驗(yàn)室備案或準(zhǔn)入要求，依法依規(guī)檢測(cè)。
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新冠病毒檢測(cè)應(yīng)當(dāng)由符合條件的醫(yī)療機(jī)構(gòu)（包括獨(dú)立設(shè)置的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室）和疾控機(jī)構(gòu)開展。醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展病原學(xué)檢測(cè)應(yīng)當(dāng)具備在設(shè)區(qū)的市級(jí)人民政府衛(wèi)生健康主管部門備案的生物安全二級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)，且符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)）的要求，具有PCR實(shí)驗(yàn)室條件。